III miRNA 1st Stand Synthesis Kit 反轉(zhuǎn)錄
Script III miRNA 1st Stand Synthesis Kit 采用Poly(A)加尾法原理， 首先miRNA 3’末端加Poly(A)尾，再使用Anchored oligo(dT)-universaltag通用逆轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，最終生成miRNA 對(duì)應(yīng)的cDNA 第一鏈。III miRNA 1st Stand Synthesis Kit 反轉(zhuǎn)錄
Script III miRNA 1st Stand Synthesis Kit 增強(qiáng)型miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒（加尾法）
III miRNA 1st Stand Synthesis Kit 反轉(zhuǎn)錄
目錄號(hào)：71418
產(chǎn)品內(nèi)容
Components | 71418-25 25 rxns (20 μl/rxn) |
miRNA RT Enzyme Mix | 50 μl |
2 × miRT Reaction Mix | 250 μl |
RNase free H2O | 1 ml |
保存條件
-20℃保存，有效期 12 個(gè)月。
產(chǎn)品簡(jiǎn)介
Script III miRNA 1st Stand Synthesis Kit 采用Poly(A)加尾法原理， 首先miRNA 3’末端加Poly(A)尾，再使用Anchored oligo(dT)-universaltag通用逆轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，最終生成miRNA 對(duì)應(yīng)的cDNA 第一鏈。
本產(chǎn)品采用特殊優(yōu)化預(yù)混合miRNA RT Enzyme Mix，將Poly(A)加尾和反轉(zhuǎn)錄合并為一步完成，簡(jiǎn)化了操作步驟并提高了Poly(A)加尾和逆轉(zhuǎn)錄效率。
本產(chǎn)品具有可從20pg-2μg 的Total RNA中高效制備miRNA對(duì)應(yīng)的cDNA 第一鏈。一次合成的cDNA可檢測(cè)多個(gè)microRNA，節(jié)約了RNA樣品和成本。
注意事項(xiàng)
1． 為保證反轉(zhuǎn)錄成功，建議使用高質(zhì)量的RNA樣品，以及避免RNase污染。
2． 在反應(yīng)中使用的total RNA 必須包含有小分子RNA(miRNA)。此過程也可以使用富集的miRNA， 單純miRNA無(wú)法直接用分光光度計(jì)定量，建議直接加入2μl ~5μl?？筛鶕?jù)目的miRNA豐度決定加入量，但是對(duì)于低豐度miRNA 樣品而言(如血清血漿提取物)，可直接加入最大體積8 μl。
3． miRNA RT Enzyme Mix比較粘稠，容易吸附在管壁和吸頭外，導(dǎo)致?lián)p失，使用前請(qǐng)點(diǎn)甩離心后取用。miRNA RT Enzyme Mix包含的酶是過量的，即使每次分別按照1.8 μl使用，也不影響使用效果。
miRNA 第一連 cDNA 合成 (以 20 μl 反應(yīng)體系為例)
重要提示：操作前，請(qǐng)將各組分輕彈混勻，點(diǎn)甩離心后置冰上備用。
1． 反應(yīng)體系的配制 (先加其他組分，最后再加入miRNA RT Enzyme Mix)于冰上，在PCR管中，加入以下組分：
Components | Volume |
Total RNA | 2 μg |
2 × miRT Reaction Mix | 10 μ |
miRNA RT Enzyme Mix | 2 μl |
RNase-Free H2O | Up to 20 μl |
輕柔吸打混勻，點(diǎn)甩離心，收集溶液至管底。
2． 42℃孵育60 min，進(jìn)行miRNA 3’末端Poly (A)加尾和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
3． 85°C加熱5 sec，終止反應(yīng)。
逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可立即用于qPCR反應(yīng)，或保存于-20°C，并在半年內(nèi)使用；長(zhǎng)期存放，請(qǐng)分裝后存于-70°C。
qPCR
推薦按照miRNA Real-Time PCR Assay kit 進(jìn)行定量實(shí)驗(yàn)。
按照上述操作步驟得到的cDNA模板，用于下游PCR或者熒光定量PCR檢測(cè)時(shí)，可以根據(jù)實(shí)際情況選擇使用量，對(duì)于特殊的檢測(cè)體系中，高含量的cDNA模板易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增，可根據(jù)所檢測(cè)miRNA 的豐度適當(dāng)?shù)南♂宑DNA（5-10倍或者100倍）后使用。如果發(fā)現(xiàn)有非特異擴(kuò)增條帶，或者融鏈曲線顯示有非特異擴(kuò)增，往往提示cDNA模板過量，可以嘗試將上述cDNA模板稀釋幾十到幾百倍甚至上千倍再使用。
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