M-MuLV Reverse Transcriptase 反轉(zhuǎn)錄試劑
本制品使用通過基因重組技術(shù)克隆表達(dá)的點突變型RNase H活性缺失的 M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶。野生型的M-MuLV 包含的RNase H活性能夠催化降解DNA/RNA雜合體中的RNA，因此在cDNA第一條鏈的合成反應(yīng)中可能會降解RNA/DNA雜合體中的模板RNA。M-MuLV Reverse Transcriptase 反轉(zhuǎn)錄試劑
Script III M-MuLV Reverse Transcriptase
M-MuLV Reverse Transcriptase 反轉(zhuǎn)錄試劑
目錄號：71117
產(chǎn)品內(nèi)容
Components | 71117-10000 | 71117-50000 |
M-MuLV (200U/ μl) | 10000 U | 50000 U |
5x RT Buffer | 250 μl | 5x 500 μl |
保存條件：-20℃保存，有效期 12 個月
產(chǎn)品簡介
本制品使用通過基因重組技術(shù)克隆表達(dá)的點突變型RNase H活性缺失的 M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶。野生型的M-MuLV 包含的RNase H活性能夠催化降解DNA/RNA雜合體中的RNA，因此在cDNA第一條鏈的合成反應(yīng)中可能會降解RNA/DNA雜合體中的模板RNA。本酶M-MuLV(RNase Hˉ)的RNase H活性缺失，與M-MuLV 相比，具有更強(qiáng)的延伸能力和穩(wěn)定性，可用于較長的cDNA合成以及高比例的全長cDNA文庫的構(gòu)建等。
適用范圍
第一鏈cDNA合成。可用于低拷貝基因的檢測。
產(chǎn)品特點
合成cDNA片段長度最高可達(dá)12 kb。
引物的選擇：
1. 如果RNA模板來源于真核生物，shou選Oligo (dT)，與真核生物mRNA的 3’PolyA尾配對，可獲得最高產(chǎn)量的全長cDNA。
2. 如果對一些物種，不能確定mRNA是否有polyA尾的情況下，shou選Oligo (dT)，不成功再嘗試基因特異性引物(GSP)和Random primer為引物。
3. 基因特異性引物(GSP)的特異性較高。但有些情況下，用于PCR反應(yīng)的GSP無法有效引導(dǎo)第一鏈cDNA合成，可改用Oligo (dT)或Random primer重新進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。
4. Random primer特異性zui低，所有RNA，包括mRNA，rRNA，tRNA均可以作為Random primer的模板。當(dāng)目標(biāo)區(qū)域具有復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)或GC含量較高，或者模板為原核生物來源，使用Oligo (dT)或基因特異性引物(GSP)無法有效引導(dǎo)cDNA合成時，可使用Random primer為引物。
5. 如果合成cDNA下游用于qPCR，可將Oligo (dT)與Random primer混合使用（各加1μl /20μl反應(yīng)體系），可使mRNA的各個區(qū)域cDNA合成效率相同，有助于提高qPCR結(jié)果的真實性和重復(fù)性。
第一連 cDNA 合成 (以 20 μl 反應(yīng)體系為例)
1.反應(yīng)體系的配制
操作前，請將各組分輕彈混勻，點甩離心收集至管底，置冰上備用。
使用 RNase-Free PCR 管在冰上配制：
Components | Volume |
Total RNA | 50 ng - 5 μg |
Oligo(dT)18 (0.5 μg /μl) or Random primer (N6) (0.1 μg/μl) or GSP (Gene Specific Primer , 2 pmol/μl) or | 1 μl |
1 μl | |
1 μl | |
5x RT Buffer | 4 μl |
RNase Inhibitor (40 units/μl) | 0.5 μl |
M-MuLV (200U/μl) | 1 μl |
RNase free H2O | To 20 μl |
2．輕柔吸打混勻，點甩離心，置 PCR 儀進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
如用Oligo(dT)18或基因特異性引物(GSP)，產(chǎn)物用于PCR：42℃孵育30 min；
產(chǎn)物用于qPCR：42℃孵育15 min。
如用 Random Primer,25℃孵育10 min 后，產(chǎn)物用于 PCR，42℃孵育30 min；
25℃孵育 10 min 后，產(chǎn)物用于 qPCR，42℃孵育 15 min。
注意：如果模板具有復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)或高 GC 區(qū)域，可以先只加 RNA 模板、引物和 RNase free H2O，混勻，65℃變性 5 min，冰上冷卻，點甩離心后加入其它成分，并將 42℃孵育溫度提升至 50°C，有助于提高產(chǎn)量。
3． 85°C加熱 5 sec，失活RTase和dsDNase，終止反應(yīng)。
逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可立即用于PCR或qPCR反應(yīng)，或保存于-20°C，并在半年內(nèi)使用；長期存放建議分裝后在-70°C保存，cDNA應(yīng)避免反復(fù)凍融。
PCR
建議取2 - 4 μl的cDNA產(chǎn)物原液作為PCR模板。
1. 常規(guī)擴(kuò)增：71019-2x Taq PCR MasterMix (30sec/kb)
71800-2x Lightning Taq PCR MasterMix (10sec/kb)
2. 高保真擴(kuò)增：71812-2x FastHiFi PCR MasterMix (≤3kb片段)
71814-2×LongHiFi PCR MasterMix (≤10kb片段)
qPCR
建議取1~2μl cDNA產(chǎn)物原液作為20μl qPCR反應(yīng)體系的模板。如果基因表
達(dá)量較高，請根據(jù)實際情況適當(dāng)稀釋cDNA模板后使用。
相關(guān)產(chǎn)品：
71519 2x SYBR Green qPCR Mix (同TB Green Premix Ex Taq)
71600 2x Universal SYBR Green qPCR Mix (適用于所有qPCR儀)
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91451 高效動物組織/細(xì)胞總RNA提取試劑盒 (動物組織、細(xì)胞)
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