羅氏蛋白酶K的廣泛應(yīng)用及保存
更新時間：2015-08-26 點擊次數(shù)：3251次
羅氏蛋白酶K是一種用途廣泛的非特異性的絲氨酸蛋白酶。在pH 4到pH 12的條件下均有活性，在SDS、尿素或EDTA存在時亦很穩(wěn)定。羅氏蛋白酶K常用于提取mRNA、基因組DNA，或用于從各種細(xì)胞中提純DNA和RNA時消化雜蛋白。還可用于糖蛋白的修飾，以及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究等方面。
羅氏蛋白酶K的應(yīng)用比較廣泛，它可以消化包圍靶DNA蛋白，因此使用羅氏蛋白酶K能夠增加探針與靶核酸結(jié)合的機(jī)會增強(qiáng)雜交信號，但在使用羅氏蛋白酶K時要注意使用的濃度，過高或者過低都會破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、核消失等影響試驗結(jié)果。
羅氏蛋白酶K的作用：
蛋白酶K在原位雜交技術(shù)中通常用于雜交前的處理，它具有消化包圍靶DNA蛋白質(zhì)的作用，以增加探針與靶核酸結(jié)合的機(jī)會，提高雜交信號。但蛋白酶K的濃度過高、消化時間過長或孵育溫度過高時，都會對細(xì)胞的結(jié)構(gòu)有一定的破壞，導(dǎo)致組織切片的脫落，細(xì)胞核的消失，從而影響雜交結(jié)果。EDTA緩沖液可以替代蛋白酶K的作用，解決上述出現(xiàn)的問題，并能達(dá)到理想的染色效果。
羅氏蛋白酶K的配制和保存
推薦反應(yīng)緩沖液：50mM Tris-HCl (pH7.5),10mM CaCl2。
蛋白酶k配制標(biāo)準(zhǔn)：20mg/ml蛋白酶K配制標(biāo)準(zhǔn)(proteinase K)：將200mg的蛋白酶K加入到9.5ml水中，輕輕搖動，直至蛋白酶K*溶解。不要渦旋混合。加水定容到10ml，然后分裝成小份貯存于-20℃。
羅氏蛋白酶K的保存：保存在-20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融，有效保證12月。孵育溫度為55至65℃，理想孵育溫度為58℃，孵育時間為15分鐘至48小時;理想孵育時間為2小時。
